载体指南

主要元件组成：复制起始点、多克隆位点及抗性筛选基因。
主要功能与应用：用于DNA复制与扩增。

主要元件组成：除了克隆载体的基本元件，还须具备转录/翻译所必须的DNA元件，如启动子、核糖体结合位点、转录终止信号。启动子驱动目标基因转录生成RNA，合成的RNA在转录终止信号下停止转录。

（1）根据启动子类型可分为组成型表达载体、组织特异性表达载体和诱导表达载体，比较如下：

（2）根据启动子来源可分为哺乳动物表达载体、酵母表达载体、大肠杆菌表达载体等。

（3）根据目标基因类型可分为常规基因表达载体、重组蛋白表达载体、非编码RNA表达载体、抗体蛋白表达载体等。

常规基因表达载体、重组蛋白表达载体、非编码RNA表达载体及抗体蛋白表达载体比较如下：

主要功能与应用：

　　（1）基因表达与功能研究：在特定宿主细胞中表达目标基因，并研究该基因在宿主细胞中的功能。这种技术对于理解基因在生物体内的作用机制、基因功能发现等具有重要意义。
　　（2）蛋白生产：用于生产具有特定功能的蛋白质。通过选择适当的宿主细胞和表达载体，可以高效地表达并纯化目标蛋白，用于生物制药、诊断试剂、工业酶等领域。
　　（3）基因疗法：在基因治疗领域，表达载体可将正常的基因导入到患者的细胞中，以替换或修复缺陷基因。通过这种表达载体介导的基因转移技术，可以实现基因在患者细胞中的长期、稳定表达，从而达到治疗疾病的目的。
　　（4）疫苗开发：表达载体将抗原基因导入特定宿主细胞中表达，诱发免疫反应可以制备出具有免疫原性的抗原蛋白。这些抗原蛋白可以用于制备疫苗，预防和控制传染病的发生。

编辑载体（Editing Vector）是一种用于基因编辑的分子工具，它通常基于质粒（plasmid）或其他DNA载体系统，并携带特定的基因编辑元件，如DNA核酸酶、识别序列以及模板DNA等，用于在目标生物体的基因组中进行精确的DNA序列修改。编辑载体的设计和构建需要高度的专业知识和技能，以确保编辑的精确性和效率。随着基因编辑技术的不断发展，编辑载体在生物医学研究、农业生物技术、基因治疗等领域的应用前景越来越广阔。

主要功能与应用：

　　（1）基因敲除：通过DNA核酸酶在特定位置切割DNA，然后依赖细胞的DNA修复机制（如非同源末端连接）来删除或破坏基因。
　　（2）基因敲入：在DNA切割后，通过提供模板DNA来引导细胞进行同源重组，从而在特定位置插入新的DNA序列。
　　（3）基因修复：类似于基因敲入，但用于修复已存在的突变或缺陷。

根据编辑对象不同，主要分为CRISPR Cas9敲除载体和CRISPR Cas13敲除载体，比较如下表：

表达调控载体通常包含启动子、增强子、沉默子等必须的顺式调控元件，以及一个或多个用于插入目标基因的多克隆位点。通过设计这些调控元件，研究人员可以精确地控制目标基因在特定时间、特定组织或特定条件下的表达水平。

主要功能与应用：

　　（1）基础科学研究：通过构建表达调控载体，可以精确地控制目标基因在特定时间或特定细胞类型中的表达，从而深入研究该基因在生物体中的功能。
　　（2）代谢工程：通过精确控制关键酶的表达水平，提高目标产物的产量或改变其代谢产物的比例。
　　（3）医药研发：通过调控治疗基因的表达来纠正或补偿缺陷基因的功能，实现疾病的基因治疗。
　　（4）作物改良：通过提高抗旱、抗病或抗虫基因的表达水平，增强作物的抗逆性。

根据调控表达形式主要分为CRISPRi载体及CRISPRa载体。详情如下表：

体外转录（In Vitro Transcription，IVT）载体，又称为无细胞转录载体，是一种在实验室条件下，利用纯化的DNA作为模板，在试管或其他容器中进行的RNA合成过程。主要用于生产和研究RNA分子。

主要功能与应用：

　　（1）mRNA疫苗和免疫治疗：通过体外转录技术，可以制备出编码特定抗原的mRNA，这些mRNA可以在体内被细胞摄取并翻译成蛋白质，从而诱导机体产生免疫反应。这种技术已经成功应用于多种传染病和肿瘤的疫苗研发中。
　　（2）基因功能研究：在分子生物学和生物技术的基础研究和教学领域，体外转录技术是一种重要的实验工具。通过体外转录实验，可以帮助学生和研究人员更深入地理解RNA的合成、加工和功能机制。
　　（3）生物合成和代谢工程：用于生产具有特定功能的RNA分子，如RNA酶、RNA适配体等。这些RNA可以用于生产特定的生物活性物质或调节代谢途径。
　　（4）诊断与检测：还可以用于生产标记有放射性同位素或其他探针的RNA分子，通过检测特定RNA分子的表达水平或结构变化，可以判断疾病的发病机制和病情进展。

根据体外转录产物不同主要分为RNA体外转录载体和mRNA体外转录载体。详情如下表：

优势：

　　（1）高效快速：可以在短时间内合成出大量的RNA/mRNA分子，满足实验需求。
　　（2）高纯度：通过体外转录系统合成的RNA/mRNA分子纯度高，不需要经过复杂的分离和纯化步骤。
　　（3）灵活性：可以合成各种长度和序列的RNA/mRNA分子，适用于不同的实验需求。
　　（4）可控性强：体外转录过程可以在实验室内进行控制，可以根据实验需要调整反应条件和时间。
　　（5）适用于大规模生产：由于体外转录系统的高效性和可控性，它适用于大规模生产RNA分子，如mRNA疫苗的生产等。

限制：

　　（1）稳定性受限：体外转录的RNA/mRNA分子在保存和运输过程中可能受到温度、湿度等环境因素的影响，导致稳定性下降。
　　（2）可能产生非特异性产物：在体外转录过程中，可能会产生一些非特异性的RNA产物，影响实验结果的准确性。
　　（3）不适用于所有类型的RNA合成：虽然体外转录系统可以合成多种类型的RNA分子，但对于某些特殊的RNA结构或功能可能无法实现有效合成。

启动子功能检测载体将目标启动子序列与报告基因（荧光蛋白、酶等）相连，并将其导入到目标细胞或组织中。当启动子被激活时，会驱动报告基因的表达，通过观察报告基因的表达情况来评估启动子的活性。

关键元件：

一个启动子插入位点及供启动子驱动表达的报告基因，以及必要的调控序列和标记基因。

特点：

报告基因多样：通常包含一个或多个报告基因，如荧光素酶或绿色荧光蛋白（GFP），用于衡量启动子的活性。

应用优势：

　　（1）快速筛选：能够快速识别和评估启动子的活性。
　　（2）定量分析：报告基因的表达水平可以量化，便于比较不同启动子的效率。
　　（3）多样性评估：适用于多种研究应用，包括启动子鉴定、功能分析和优化。
　　（4）技术成熟：利用双荧光素酶报告系统进行转录调控元件活性及结合位点预测等实验设计思路与细节已经非常成熟。

应用限制：

　　（1）背景噪声：某些载体可能存在非特异性表达，导致背景噪声。
　　（2）宿主限制：启动子的活性可能受到宿主细胞类型的影响。
　　（3）成本：购买或构建高特异性的检测载体可能成本较高。

蛋白互作检测通常通过构建融合蛋白表达载体来实现，其中目标蛋白序列与报告基因或标签序列融合，并在宿主细胞中共表达这两个融合蛋白。当这两个融合蛋白发生相互作用时，它们能够激活或抑制与它们相连的报告基因，从而引发可测量的信号变化，如荧光强度的增强或颜色的改变。通过检测这些信号变化，研究人员能够评估并量化蛋白质之间的相互作用。

关键元件：

目标基因插入位点、用于报告蛋白互作的报告系统元件。

特点：

　　（1）双报告基因系统：通常包含两个报告基因，用于监测蛋白间的相互作用。
　　（2）融合标签：载体设计包含融合蛋白标签，如GST、His或Flag，便于蛋白的纯化和检测。
　　（3）信号放大：一些载体通过信号放大机制提高检测的灵敏度。

优势：

　　（1）实时监测：可以实时监测蛋白互作的动态过程。
　　（2）定量分析：提供了一种定量分析蛋白互作强度的方法。
　　（3）高通量筛选：适用于大规模筛选实验，有助于快速识别互作蛋白。
　　（4）应用广泛：可用于药物筛选、疾病机制研究和信号传导途径分析。

限制：

　　（1）假阳性/假阴性：可能由于非特异性结合或实验条件不当导致错误结果。
　　（2）局限性：蛋白互作检测载体通常只能检测到已知蛋白质之间的相互作用，对于未知的蛋白质相互作用可能无法检测。此外，一些低亲和力或瞬时的蛋白质相互作用也可能无法被检测到。