【背景】
CRIPSR-Cas9系统是一种有效、便捷的基因组编辑技术,通过sgRNA介导突变后不具有切割活性的Cas9核酸酶(dCas9),结合特定的DNA序列位点,可以抑制或激活细菌的基因表达。目前,许多研究中需要精确地调节基因表达,而不仅仅是让基因功能完全丧失,也可以促进或者抑制基因表达,因此dCas9技术激活或抑制基因表达的研究也受到了极大的关注,科研人员认为人为控制基因的转录对于基因功能的研究和基因网络的构建具有重要意义。
【方法】
- 构建dCas9质粒系统,对Cas9基因10位点和840位点进行突变,使其失去对DNA双链的切割活性。dCas9蛋白结合到靶基因的转录起始位点,阻止RNA聚合酶的结合,从而达到抑制转录起始和转录延伸的作用;
- 构建了一系列与目标序列不匹配的crRNA,通过对crRNA 5’末端进行突变,形成 8个不同碱基突变的crRNA,将其转入到细胞中检测对基因表达造成的影响;
- 将ω亚基和dCas9的C-和N-终端融合链接起来,可以在启动子的上游稳定的结合RNA聚合酶从而促进激活转录,并根据启动子序列的不同位置设计了4个不同的crRNA,用来控制lacZ基因的表达;
- 在-35启动子区域不同位置设计了10个crRNA,通过控制gfp-mut2基因的启动子调节基因表达。
【结论】
- 为了评估和检测dCas9对启动子表达和转录延伸的抑制效果,构建GFP报告载体。结果显示,在启动子的-35和-10区域,dCas9减少了超过100倍的荧光,由此说明,dCas9靶定启动子区后,能够抑制启动子表达,编码区域和非编码区域都观察到了荧光的减弱,说明dCas9结合基因组后能够阻止RNA聚合酶的结合;
- 不完全匹配的crRNA也可以调节dCas9的抑制表达水平,3’末端12个互补的dCas9序列(即8个不匹配序列)转录抑制的效果最强;
- 同时检测了不同crRNA介导Cas9对DNA切割的能力,结果显示对于不同的crRNA来说,不同匹配度的crRNA对DNA切割造成的影响也是不同的;
- crRNA结合的位点与lac基因表达具有一定的相关性,Z4位置的crRNA的激活效果最好,具有2.8倍的激活率。但是,并不是所有的位点都可以促进基因表达,如果过于接近启动子位点,则可能会抑制基因表达;
- 10个不同crRNA中,W103和W108 crRNA能够强效激活gfp-mut2基因表达;
- 使用W103和W108对gfp-mut2基因的三个变体进行激活测试可以得知,不同的启动子介导dCas9可以使基因过表达,表达量与启动子的类型具有一定的相关性。
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参考文献
Bikard, D., et al., Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Res,2013. 41(15): p. 7429-37.